Il Museo, creato nel 1967 per accogliere opere provenienti dalla Cattedrale, è stato ampliato in più tempi e recentemente ristrutturato, in un suggestivo percorso intorno all’armonioso chiostro romanico, con opere provenienti dall’intera diocesi.
Dal 1989, a seguito di accordi tra Comune e Diocesi, è stato creato il Sistema Museale Pratese, del quale fanno parte anche i Musei Diocesani (Opera del Duomo, Museo della Pittura Murale, Museo della Pieve di Figline, Museo della Badia di Vaiano).
La prima sala conserva tavole e pannelli di polittici del XIV-inizi XV secolo (di Giovanni Bonsi, Lorenzo di Niccolò, Giovanni Toscani), notevoli sculture (tra le quali una testa di Crocifisso del 1220-30 e un vigoroso rilievo di Giroldo da Como, del 1262 circa) e suppellettile sacra del XIV-XV.
La sala seguente ospita il prezioso Parato di santo Stefano, donato dal proposto Alessandro de’ Medici (Leone XI), e vari corali miniati del XV secolo (Rossello Franchi, Attavante Attavanti).
La sala contigua è dedicata al culto della Sacra Cintola della Madonna, la reliquia più preziosa del territorio, e mostra tra l’altro alcuni vibranti rilievi marmorei di un pulpito esterno e forse di un dossale, scolpiti nel 1358-60 dal senese Niccolò del Mercia.
Attraverso una zona seminterrata – lo scavo ha messo in luce reperti dal periodo etrusco al XV secolo e modeste strutture altomedievali – si raggiunge la Sala del Quattrocento, dove sono esposti dipinti rinascimentali, tra i quali il capolavoro pratese di Filippo Lippi, le Esequie di san Girolamo (1453 ca.), una preziosa tavola di un suo allievo, Piero di Lorenzo (1449), e un Crocifisso sagomato di scuola botticelliana.